自旋捕獲電子順磁共振方法在研究反應活性中間體中已得到廣泛應用，并發展為一種可靠的實驗方法。對于生物體系中的低濃度、短壽命自由基，自旋捕獲技術結合電子順磁共振技術，在常溫下便可對其進行檢測。對于不同的自由基，其與捕獲劑加合反應后形成的加成物的EPR譜圖不同，可以根據EPR譜圖結果反推出自由基的種類，對其進行識別。本文以DMPO為例，給大家簡單介紹下DMPO捕獲自由基的簡單譜圖分析。 DMPO捕獲譜圖基本原理 使用DMPO作為自旋捕獲劑時，自由基會加成到DMPO中Cα=N上的Cα上，由于電子和核的超精細相互作用，氮和氫核會使EPR譜圖由單一的峰裂分為多個峰。對于不同的自由基，形成的自旋捕獲加成物中氮核、氫核等磁性核與電子的超精細相互作用不同，會導致EPR譜圖不同，因此可根據EPR譜圖結果提供所捕獲的自由基的信息。 圖1 DMPO捕獲自由基原理 DMPO捕獲自由基EPR譜圖解析 當我們采集到一張自旋捕獲EPR譜圖時，可通過四步方法來確定測試的自由基種類。 （1）確定信號出峰范圍 對于DMPO捕獲自由基形成的加成物，其EPR譜圖出峰的范圍通常為2AN+AHβ+AHγ，一般AHγ?AHβ。以DMPO捕獲?OOH為例，AN、AHβ、AHγ如圖2所示。根據較低場與較高場超精細分裂峰的間隔，可初步判斷自由基種類。如對于飽和烷基，2AN+AHβ約為52 G；不飽和烷基，2AN+AHβ大于56 G；烷氧自由基，2AN+AHβ小于35 G；羥基自由基，2AN+AHβ約為45 G；超氧陰離子、過氧和烷過氧自由基，2AN+AHβ約為38 G。具體數值可參照蘇吉虎老師著作《電子順磁共振波譜：原理和應用》。 圖2 DMPO捕獲?OOH的EPR譜圖 （2）確定峰的個數與強度 對于不同的自由基，被DMPO捕獲后形成的加成物的峰的個數與強度會有所差別。可根據峰的個數與強度進行初步判斷。比如DMPO捕獲羥基自由基后形成的加成物的EPR譜圖有四條峰組成。這主要是因為對于DMPO-*OH，AN≈AHβ，所以四條峰強度比為1：2：2：1，如圖3所示。 圖3 DMPO-*OH的EPR譜圖 （數據由國儀量子EPR系列產品測試所得） （3）判斷AHβ大小 對于具有相同信號峰個數的EPR譜圖，可根據AHβ的大小進行分辨。例如烷氧自由基與超氧陰離子自由基，兩者的EPR譜圖均為6個峰，譜圖較為相似，常會被混淆。 在超氧自由基捕獲實驗中，通常將烷氧自由基歸屬于超氧陰離子。那么如何判斷捕獲到的自由基是烷氧自由基還是超氧陰離子呢？此時可通過EPR譜圖AHβ的大小來進行判斷。 對于烷氧自由基，AHβ=7~8 G，對于超氧陰離子，其AHβ=9~12 G，如圖4所示，且烷氧自由基的超精細分裂峰普通比較寬，且形成重疊，即使降低調制幅度也無法作去卷曲處理。其他類型自由基的超精細分裂峰的峰-谷間隔都比較小，不易發生重疊。 圖4 DMPO捕獲烷氧自由基與超氧陰離子的EPR譜圖對比 （4）加入清除劑進行二次驗證 對于羥基自由基、超氧陰離子等可通過加入清除劑，看信號是否減弱進行二次驗證。例如，對于羥基自由基，可加入甲醇、乙醇、DMSO等進行二次驗證。對于超氧陰離子自由基，可通過加入超氧化物歧化酶（SOD）進行二次驗證。 圖5 使用乙醇清除?OH進行二次驗證 （數據由國儀量子EPR系列產品測試所得）